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上轉換發光免疫層析技術及其在食品安全檢測中的應用

文檔作者：任舒悅1 姜會聰1一，彭媛1，白家磊1寧保安1，高志賢文檔來源： 1．軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所 2．鄭州大學公共衛生學院		點擊數：	更新時間： 2025年07月02日
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第7卷第5期
2016年5月
食品安全質量檢測學報
Journal of Food Safety and Quality
Vbl．7 No．5
May，2016
上轉換發光免疫層析技術及其在食品安全
檢測中的應用
任舒悅1，姜會聰1一，彭媛1，白家磊1寧保安1，高志賢p
(1．軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所，天津市環境與食品安全風險監控技術重點實驗室，天津300050；
2．鄭州大學公共衛生學院，鄭州450001)
摘要：食品安全是關系到億萬人民健康生活的頭等大事，保障食品安全的快速檢測技術在不斷進步。傳統的
理化檢測方法存在樣品前處理復雜、耗時費力、成本居高不下等問題，只能作為疑似樣品的確證方法，不能滿
足質量安全監督現場篩查的需求。上轉換發光免疫層析技術是建立在功能化上轉換發光納米材料與抗原抗體
特異結合的層析技術基礎上的一種新興技術，具有靈敏度高、特異性強、使用便捷、檢測速度快等特點，被廣
泛應用于快速檢測過程中。本文對上轉換發光技術及免疫層析技術進行了簡要介紹，主要對上轉換免疫層析技
術以及其在食品安全檢測領域的應用進展進行了綜述。通過分析目前技術的優點與不足，根據目前的應用領域，
提出了發展方向，為該技術在食品安全領域的進一步應用提供了參考。
關鍵詞：上轉換發光；免疫層析；食品安全檢測
Up--converting phosphor technology--based immunochromatographic assay
and its application in the field of food safety detection
REN Shu—Yuel，JIANG Hui．Con91，2，Peng Yuanl，BAI Jia-Leil，NING Bao—Anl，GAO Zhi．Xianl‘
(1．刀口形in Key Laboratory ofRisk Assessment and Control Technologyfor Environment and Food Safety，Institute of
Health and Environment Medicine，Military Medical Sciences，乃明，in 300050，China；
2．School ofPublic Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China)
ABSTRACT：Food safety is one of important things in the healthy lives of billions of people，and rapid detection
technology for food safety was constantly progressive．The traditional physical and chemical methods exist many
problems to be solved，such as complex sample preparation，time consumption and high cost，which can only be used
for confirming the suspected samples but not for the screening on the scene．However，up-converting phosphor(UCP)
technology—based immunochromatographic assay，a new technique，which is based on functional up-converting
phosphor and the special combination of antigen—antibody,has the characteristics of high sensitivity,high specificity,
ease to use，rapid detection and so on，being widely used in the process of rapid detection．In this paper,it took a brief
introduction to immunochromatographic assay and UCP technology．Mainly,it also reviewed the progress of the
application of this technology and its application in food safety detection．Through the analysis of the advantages and
基金項目：國家自然科學基金項目(21477162)、天滓市科技支撐計劃項目(14zCzDSF0021)
Fund：SuppoSed by the National Natural Science Foundation of China(21477162)and the Science and Technology Support Projects of
Tianjin(14ZCZDSF0021)
+通訊作者：高志賢，研究員，主要研究方向為食品安全風險監控技術。E—mail：gaozhx@163．com
+Corresponding author：GAO Zhi·Xian，Researcher,Institute of Health and Environment Medicine，No，1，Dali Road，Tianjin 300050，China．
E—mail：gaozhx@163．com
萬方數據
第5期任舒悅，等：上轉換發光免疫層析技術及其在食品安全檢測中的應用1859
disadvantages of the present technology,the development direction was put forward according to its application field
at present，which provided a reference for the further application of the technology in the field of food safety．
KEY WORDS：up-converting phosphor；immunochromatographic assay；food safety detection
1 引言
“民以食為天”，食品是人類生存的最基本、最重要的
元素，食品安全是關系到億萬人民健康生活的頭等大事。
近年來，雖然我國環境狀況與過去相比有了長足的進步，
但是隨著市場經濟的發展和新的有毒有害物質的出現，仍
存在著不少不安全因素，所以，保障食品安全的快速檢測
技術需要不斷地更新。傳統的理化檢測方法如液相色譜法、
氣質聯用法、毛細管電泳法等雖具有準確的突出特點，但存
在樣品前處理復雜、耗時費力、成本居高不下等問題，只能
作為疑似樣品的確證方法，不能滿足質量安全監督現場篩
查的需求【1】。近幾年現代生物技術在食品安全檢測領域也
得到了一定的應用，例如DNA探針、聚合酶鏈式反應、生
物芯片及酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)等技術，具有對靶
標分子高效富集、特異性高、快速檢測等優點【2。4】。但這些
技術存在樣品前處理復雜、抗體制備困難、生物原料容易
失活、檢測微環境要求較高等缺點，限制了其在食品污染
物現場篩查中的廣泛應用【5】。因此，建立一種適用于現場
的簡單快速食品污染物篩查技術是保障食品安全的必要途
徑之一。
2上轉換發光免疫層析技術
2．1免疫層析技術
免疫層析技術(immunochromatographic assay,ICA)是
建立在層析技術和抗原一抗體特異性免疫反應基礎上的一
項新興免疫檢測技術，具有簡單、快速、靈敏度高等特點，
適合現場及大量樣品的檢測。免疫層析技術以固定有測試
線和質控線的條狀纖維層析材料為固定相，以測試液為流
動相，通過毛細管作用使待測物在層析試紙條上移動，經過
檢測線時發生特異性免疫反應，游離物在質控線處發生免
疫反應，最后通過測試線顏色的深淺判斷測試結果[6l。目前，
最為成熟的現場快速檢測技術平臺當屬免疫層析，其基于
膜的側向橫流檢測模式一方面在滿足檢測敏感性特異性的
前提下，提高了操作的簡便性；另一方面提高了試劑的儲
存穩定性。但常規使用的膠體金、熒光染料等生物示蹤物
由于無法準確定量、熒光蟀滅明顯等缺陷，嚴重限制了免
疫層析技術在食品檢測領域的應用。
2．2上轉換發光技術
上轉換發光(up—converting phosphor，UCP)顆粒是由稀
土元素構成的發光晶體材料，稀土元素具有f電子層賦予
UCP顆粒獨特的上轉換發光特異，即可由低能的紅外光激
發從而發射高能的可見光[71，目前常用的上轉換發光材料
主要由稀土元素構成。
基于對UCP顆粒的研究不斷深入，上轉換發光技術
(up-converting phosphor technology,UPT)應運而生。UPT即
通過對上轉換發光納米顆粒進行表面修飾，包括硅烷化
法、配體交換法、配體氧化法、聚合物包覆法、表面鈍化
法及主客分子相互作用等【8‘12】方法將納米顆粒與生物分子
連接并進行標記以實現在生物成像、藥物運輸、傳感器以
及儀器制造方面的廣泛應用【13’18l。由于其作為生物示蹤物
可完全排除生物背景熒光干擾，在檢測中具有高度的敏感
性、特異性與穩定性。所以，該技術在高通量藥物篩選與
輸送、基因組學研究、光動力學治療、組織成像、食品環
境檢測以及生物戰劑的防御等多方面潛在的應用價值不容
忽視‘1 91。
2．3上轉換發光免疫層析技術
上轉換發光免疫層析技術(up．converting phosphor
technology-based immunochromatographic assay)是建立在
上轉換發光納米材料與抗原抗體特異結合的層析技術基礎
上的一種新興技術，是以上轉換納米顆粒為標記物的新型
快速檢測方法。免疫層析試紙包含5個基本組成部分：樣
品墊、結合墊、分析膜、吸水墊、粘性底襯。當進行檢測
時，首先將樣品滴加到樣品墊上，樣品通過滲透與虹吸作用
進入結合墊，使其中固定的UCP顆粒與生物活性分子結合
物重新溶解游離，并在吸水墊的虹吸作用下，離開結合墊進
入分析膜，向吸水墊的方向流動。此過程中UCP顆粒與生
物活性分子結合物、目標被檢物、檢測帶c線、質控帶T
線之間將特異地發生一定的免疫反應，并通過標記物產生
具有指示性的信號，通過UPT生物傳感器進行信號收集
(如圖1)，對層析過程中經特異性免疫反應聚集于檢測帶(T)
和質控帶(c)的UCP顆粒的信號進行掃描分析，計算T／C
值即可消除試紙條和加樣的系統誤差，從而實現快速、簡
便、敏感、精確、穩定的定量檢測【201。
UCP顆粒作為標記物，與膠體金、磁性納米材料、乳
膠微球、量子點、熒光素等相比，該標記物屬于惰性無機
發光材料，具有耐用性強、穩定性好、有效期長、通量高、
無干擾等特點，已成為標記免疫層析技術的研究熱點f2”。
目前，依據在試紙條上所發生免疫反應方式的不同，應用
上轉換免疫層析技術檢測的反應模式主要可分為夾心模
式、競爭模式與間接模式【221。基于這3種反應模式，上轉
換免疫層析技術在臨床疾病病原體檢測中得到充分的應
萬方數據
1860 食品安全質量檢測學報第7卷
用。例如，病原微生物(細菌、病毒相關抗原或抗體、寄生
蟲相關抗原或抗體)的檢測、細胞因子的檢測、人體激素疾
病相關蛋白的檢測等。其中具有代表性的當屬軍事醫學科
學院微生物流行病研究所的楊瑞馥教授課題組，已經成功
研發出布魯氏菌、鼠疫耶爾森菌、乙型肝炎病毒、腸出血
性大腸桿菌(大腸桿菌0157)、霍亂弧菌等單靶標UPT免疫
層析試紙條以及UPT十通道多重定量檢測試紙盤[23-25】。
搶
測
帶
樣結分
品合析
墊墊膜
粘
性
底
襯
吸
水
氆
圖1 免疫層析反應過程、對應試紙卡‘20
Fig．1 Immunochromatography reaction process and the test card[20
3 上轉換發光免疫層析技術在食品安全檢測中
的應用
3．1 食源性致病菌的快速檢測
目前，上轉換發光免疫層析技術在食品安全檢測領
域研究逐步開展，集中在食源性致病菌等的研究較多。例
如，劉旭等【26】針對Listeria monocytogenes(LM)特異的p60
蛋白制備單克隆抗體，并與上轉發光納米顆粒共價偶聯作
為結合物，采用雙抗體夾心免疫層析模式建立
LM．UPT-LF，并對其敏感性與特異性進行評價。建立的
LM．UPT-LF操作簡便快速，具有良好的敏感性和特異性，
適用于一線病原調查與檢測。又如，北京工業大學馬雪梅
課題組[2”將200～300 am的上轉換熒光納米顆粒進行羧基
化修飾，使之成為水溶性好、分散性高且易于與生物分子
偶聯的標記物。采用競爭反應模式，建立免疫層析試紙。
近幾年，軍事醫學科學院微生物流行病研究所的楊瑞馥教
授課題組將上轉換發光免疫層析技術的應用擴展到了食品
領域，王浩然等【2 8】在成功研制10種可滿足食源性致病菌
現場檢測需求的UPT單靶標檢測試紙的基礎上建立
UPT_LF十通道系統(見圖2)。其中乙型副傷寒沙門氏菌、
霍亂弧菌01、0139群可達104 CFU／mL；大腸桿菌0157
和甲型副傷寒沙門氏菌可105CFU／mL；腸炎沙門氏菌、豬
霍亂沙門氏菌和副溶血弧菌可達106 CFU／mL；傷寒沙門
氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌可達107 cFu／mL。均可滿足
食物樣本增菌檢測和腹瀉樣本直接檢測的靈敏度需求。／．偷，，／厶＼日少Σ＼
@悸＼≮◆鄉6＼哆／／
＼喜：l／／
圖2十通道試紙盤結構圖∞1(左為內部圖，右為外部圖)
Fig．2 Ten channel test strip structure diagram[28]
(1eft for the internal structure，right for the external structure)
劉曉等【29】以UCP顆粒作為標記物，無需樣品前處理，
采用競爭免疫反應建立AFMl．UPT-LF方法，可實現粉及
牛奶中AFMI定性及定量檢測，20 min內即可完成。在定
性檢測中，對奶粉檢測靈敏度為100％，特異性為85％，具有
較好回收率，可滿足食品安全中對現場快速檢測的需求。
各種細胞、細菌、寄生蟲等皆為顆粒性抗原。其中顆
粒性抗原的細菌多用液體或固體培養物，經集菌后處理。
一般選擇在大腸桿菌表達系統中克隆、表達細菌的蛋白，
經鎳柱親和層析純化，包涵體形式的表達蛋白經尿素梯度
透析復性，獲得有活性的重組蛋白，以各重組蛋白為抗原
分別常規免疫動物，從免疫血清中提取抗體，經正辛酸一
硫酸銨法純化獲得蛋白相應的抗體lgG。再以配對的抗原
抗體為生物材料研制UPT單靶標抗體檢測試紙，用UCP
標記抗原，以雙抗原夾心模式檢測其對應抗體，以含有各
種純化細菌抗體IgG的血清等為模擬樣品。收集血清樣本
凍存，按實驗設計所需量取出部分，室溫平衡后，用樣品
處理液1：10倍稀釋待測標本，通過對模擬樣品的檢測評價
各試紙的檢測性能。上轉換發光免疫層析技術用于食品中
細菌的檢測主要還存在以下一些問題：(1)細菌的單克隆
抗體受免疫源性限制，耗時長且制備過程復雜，因此不易
獲得，限制了細菌檢測的發展；(2)用于食品中細菌檢測的
免疫層析試紙條靈敏度不高，部分檢測限高于ELISA，而且
萬方數據
第5期任舒悅，等：上轉換發光免疫層析技術及其在食品安全檢測中的應用1861
線性略低也說明了穩定性不是特別好；(3)用于細菌檢測的
試紙條的變異系數略偏大，而且不夠穩定，也說明了該技術
的精密度還有待提高；(4)處理細菌樣品時，難免會有一些復
雜基質，因此在檢測時易出現假陽性結果，影響實驗。
3．2農獸藥殘留的快速檢測
目前，用于檢測食品中農獸藥殘留的UPT免疫層析
試紙的研究仍未見報道。但天津科技大學張旋旋等(30J首次
應用上轉換免疫分析方法檢測蔬菜、果汁與水樣中的烯啶
蟲胺的殘留。將純化得到的烯啶蟲胺多克隆抗體偶聯到
PAA—UCNPs表面形成信號探針，將烯啶蟲胺包被抗原偶
聯到聚苯乙烯微球的表面形成感應探針。建立烯啶蟲胺的
上轉換免疫標準曲線，定量限為l ng／mL．線性范圍為
1～10000 ng／mL。測定與其他3種煙堿類殺蟲劑與7種其他
類型殺蟲劑的交叉反應率很低，具有很好的特異性。并且建
立了與方法匹配的樣品前處理方法：選取4種蔬菜樣品、4
種果汁樣品與4種水樣品，對樣品前處理條件的進行優化，
消除了樣品基質影響，得到一套簡單可行的樣品處理方法，
建立了一種耗時短、靈敏度高、特異性高、準確性高的簡
便、快速、高效的新型上轉換免疫分析方法。該研究為研
發食品農獸藥殘留快速檢測UPT免疫層析試紙提供了有
力的依據，具有很大的參考價值。
4面臨的問題與展望
美國自1995年開始基于UPT的免疫層析技術研究，
進行生物戰劑的現場快速檢測與預計，2006年以違禁藥品
檢測為切入點開始進行民用領域的推廣。但在國內研究上
轉換顆粒合成及其應用的課題都停留在實驗室階段，并沒
有做成用于現場檢測的產品，僅有中國科學院、軍事醫學
科學院、北京熱景生物公司等致力于將實驗成果轉化為惠
及百姓的快檢產品。但這些機構的研究多集中在核酸及病
原菌的檢測等臨床應用方面，在食品安全檢測領域的研究
相對較∥31。3引。推測原因其一是食品樣品前處理復雜，缺
乏可用于現場快速的有效前處理方法。其二是食品中污染
物大部分屬于小分子物質，其單克隆抗體制備困難、容易
失活且檢測微環境要求較高等，限制了該技術在食品污染
物快速檢測中的廣泛應用【361。上轉換發光免疫層析技術的
應用存在一些不足之處，但其靈敏度高、特異性強、使用
便捷、檢測速度快等優勢以及國內外強大的市場需求，預
示著該項技術在食品安全領域具有廣闊的應用前景。食品
污染按污染源的性質可分為：生物性污染、化學性污染、
放射性污染。來自生產、生活和環境中的污染物，如農藥、
有害金屬、多環芳烴化合物、N．亞硝基化合物、包裝材料
及涂料等溶入食品中的原料材質、單體及助劑等物質【37】。
近幾年，環境中的污染物通過食物鏈向食品中轉移，
對人體內各種組織、器官和細胞產生的低劑量長期內照射
效應不容忽視問題。對人體的危害主要表現為對免疫系統、
生殖系統的損傷和致癌、致畸、致突變作用【381。所以，目
前食品中的各類污染物的監測急需建立一種樣品前處理簡
單快速、檢測靈敏度高、穩定性特異性好的現場篩查技術。
食品中農、獸藥殘留以及環境中富集到食品中的激素類污
染物的快速檢測試紙本課題組正在進行研發，目前少有文
獻報道相關研究。本課題組多年來從事化學危險因子、食
源性致病菌、激素類污染物以及農獸藥殘留等食品安全方
面的風險監控與技術研究。課題組對上轉換納米材料的合
成、修飾以及應用進行了初步探索[39,40]，并將上轉換納米
顆粒與分子印跡技術結合研制出了檢測磺胺類藥物的生物
傳感技術141]。近期課題組致力于農獸藥殘留的上轉換快速
免疫層析試紙的研發，研制出適用于現場快速篩查的便攜
式檢測技術，應用到實際生活中。
綜上所述，建立上轉換免疫層析快速檢測食品中污
染物殘留的單靶標試紙以及研發多靶標定量多通道檢測試
紙盤是建立食品安全現場快速篩查技術平臺的關鍵。因此，
以UCP作為標記物發展起來的上轉發光免疫層析技術具
有特異性強、敏感性高、穩定性好、儲存期長，可同時進
行多重分析且不受檢測環境影響等優勢，勢必在食源性致
病菌、農獸藥殘留、違禁藥品或添加劑、生物毒素、重金
屬離子等對人體有害的物質檢測領域具有巨大的應用潛力
和發展前景，為保障食品安全開辟了一條嶄新的途徑。
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f責任編輯：金延秋)
任舒悅，碩士，主要研究方向為上轉
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E-mail：15620163753@163．corn
高志賢，博士，研究員，主要研究方
向為食品安全風險監控技術。
E—mail：gaozhx@163．com

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